本文原载于中华医学杂志年04期
大疱性表皮松解症(epidermolysisbullosa，EB)是一组少见的单基因遗传病，共同的临床表现为皮肤出现水疱或大疱，以电镜检查为标准，根据水疱及裂隙发生的位置，分为单纯型EB(EBS)、交界型(EBJEB)、营养不良型表皮松解症(dystrophicepidermolysisbullosa，DEB)和Kindler综合征[1]。DEB是EB中较少见的类型，根据遗传方式不同分为常染色体显性遗传营养不良性大疱性表皮松解症(dominantdystrophicepidermolysisbullosa，DDEB，MIM#)和常染色体隐性遗传营养不良性大疱性表皮松解症(recessivedystrophicepidermolysisbullosa，RDEB，MIM#)，两种类型的病变基因相同，RDEB症状较其他类型更重，预后差[2]。
编码Ⅶ型胶原蛋白的COL7A1基因突变是DEB的致病基因，COL7A1基因突变导致Ⅶ型胶原减少，甚至缺如，从而使皮肤基膜致密板下层锚丝纤维不能维持正常功能。锚丝纤维的主要结构成分是Ⅶ型胶原，Ⅶ型胶原在维持真皮与表皮连接结构稳定性中具有非常重要的作用，它的缺失或形态异常会导致真皮与表皮连接结构不稳定，使皮肤在机械创伤或表皮摩擦时，发生表皮与真皮的分离，形成水疱，水疱破溃后表面形成糜烂面，从而形成DEB。COL7A1基因定位于3号染色体3p21.1，全长31.kb[3]，包含个外显子。该基因外显子较多，应用Sanger测序对其进行检测，耗时、耗力，而新一代测序(next-generationsequencingtechnology，NGS)具有简便、经济、准确、高效的优点，但NGS数据结果需通过Sanger测序进一步验证。本研究我们对2个DEB家系首先通过NGS技术对COL7A1全基因进行突变检测，发现序列变异后，采用Sanger测序验证该变异，致病突变证实后，在此基础上对其中一个家系中先证者母亲再次怀孕的胎儿进行了孕早期产前诊断。
对象与方法
一、病例来源及临床情况
2个无亲缘关系的DEB家系来自医院产科和小儿内科，分别于年10月和年4月来院就诊。
家系1，先证者，女，出生后3d，父母表型正常，非近亲结婚，无家族史。第1胎第1产，患儿生后反应较差，哭声低哑，双下肢皮肤剥脱，余身上皮肤有散在水疱，剥脱处皮肤潮红渗液，Nicolsky征阳性，口腔黏膜糜烂，可见水疱(图1)。辅助检查：血常规白细胞20×；疱液革兰染色涂片未检出细菌；梅*螺旋体检测阴性。对症治疗后效果较差，患儿出院后不久死亡。留取先证者、父母外周静脉血用于基因诊断。先证者母亲再次怀孕11周，为避免生育患者，请求产前诊断。
图1
家系1患儿皮肤表现
家系2，先证者，女，4岁，父母表型正常，非近亲结婚，无家族史。足月顺产，出生后不久四肢出现水疱、血疱，易摩擦处为著，随年龄增长，水疱愈合后留下萎缩性瘢痕或肥厚性的瘢痕疙瘩，伴有厚甲和营养不良甲，口腔未见水疱、糜烂。辅助检查：血常规、肝肾功能、传染病检测未见异常。
2个家系中先证者结合临床表现和皮肤组织病理检查临床诊断为DEB。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有基因诊断工作均取得患者及家属的同意并签署知情同意书。
二、方法
1．标本采集及处理：
经患儿父母知情同意对患儿进行了皮肤活组织病理检查；采集家系中患者及其父母外周静脉血3ml，EDTAK2抗凝；家系1于妊娠11周时，超声引导下经腹抽取胎儿绒毛标本进行产前诊断。选取名健康个体DNA作为正常对照标本。所有样本用北京天根DNA试剂盒提取DNA，操作步骤按照试剂盒的说明书进行。
2．NGS测序：
提取基因组DNA(无降解，总量10μg以上，50ng/μl以上，使用分光光度计测定吸光度A值在1.8～2.0之间)，Covaris公司的M工具随机分解成长度介于～bp之间的片段。采用罗氏NimbleGen公司的基于2.1M外显子序列捕获芯片(SequenceCapture2.1MHumanExomemicroarrays)和Illumina公司的Hiseq测序平台。将绑定引物的DNA片段，杂交到NimblegenSeqCapEZ文库芯片(生物素化寡核苷酸DNA探针)，进行扩增，未杂交片段则被洗脱。将基因组DNA的随机片段附着到Flowcell进行高通量大规模平行测序。
3．PCR扩增：
参考文献[4]设计COL7A1基因第58、67、72和外显子共4对引物，常规PCR扩增，反应总体系25μl，PCR反应总体系为25μl，内含dNTP2.5mmol/L，Taq酶1U，上、下游引物各0.2μmol/L，DNA模板50ng。扩增条件：94℃预变性3min，94℃30s，复性温度55～64℃退火40s，72℃50s，30个循环后，72℃延伸8min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，确定产物大小与预期一致。
4．DNA测序：
PCR产物纯化后采用ABIBigDye3.1测序试剂盒，在ABIxl基因测序仪上对产物直接进行双向测序，用Chromas软件将测序结果NGS所发现变异序列进行比对分析，寻找基因突变位点。
5．突变命名和验证：
新序列变异通过检索HGMD数据库