摘要：
一种新的测量系统能够将连续血糖监测(CGM)和胰岛素输注结合起来。包括光学葡萄糖生物传感器和光学氧传感器的传感器系统被集成到胰岛素泵的胰岛素输注导管中。两种传感器都依赖于近红外(NIR)磷光卟啉染料，因此可以使用定制的相位荧光计测量模块经皮和无创地读取信号。指示染料的光谱特性和测量模块的光学设置经过优化，可以在两个通道中独立读取。氧气和葡萄糖传感器分别覆盖从0mmHg到mmHg氧气和0mg/dL到mg/dL葡萄糖（LOD2mg/dL）的动态范围。猪的体内测量表明参考血糖水平和使用所提出的传感器系统获得的葡萄糖值之间具有良好的相关性。使用克拉克误差网格分析对系统的临床准确性进行评估，结果与目前市场上的CGM设备相似。
一、简介
糖尿病是一组由完全或部分胰岛素缺乏引起的复杂代谢疾病。根据世界卫生组织(WHO)的数据，全世界约有3.47亿人患有糖尿病（WHO，年）。连续血糖测量和适当的胰岛素给药对于实现良好的血糖控制、使糖尿病患者的葡萄糖代谢正常化和降低1型糖尿病(T1D)急性和长期并发症的危险是必要的。目前，糖尿病患者通过获取毛细血管血液的手指刺样本来自我监测他们的血糖水平，他们将其应用于测试条和便携式仪表进行分析。这种痛苦的过程每天进行数次，并可能导致手指角化和敏感性下降。此外，可能会错过夜间或采样之间发生的低血糖或高血糖发作。已经表明，CGM对患有T1D的儿童非常有益，而且对患有T1D和夜间低血糖事件的成年人也非常有益。目前流行的治疗方法无法实现CGM，因为糖尿病患者不能耐受更频繁的测量。过去几十年的研究旨在开发闭环系统和具有自动连续葡萄糖测量和调整胰岛素输送的人工胰腺。MiniMedParadigmsREAL-TimeRevel系统或带有Enlites的MiniMedsG是具有集成CGM系统的市售胰岛素泵的示例。市场上的其他CGM系统包括SevensPlus、FreeStyleNavigatorII或GlucoDaysS。
与传统（例如电流型）葡萄糖传感器相比，光学传感器受益于没有电磁干扰、设计和处理简单以及成本低。光学传感器的小型化很容易实现，而不会影响性能并显着减少排斥反应。显然，光学传感技术可以为更成熟的电化学传感器提供有趣的替代方案，并将有助于在CGM系统的设计、成本、使用的材料等方面提供更好的灵活性。
已经报道了几种光学葡萄糖监测方案。例如基于天然受体的亲和传感器，如伴刀豆球蛋白A或合成受体如硼酸，以及荧光水凝胶或依赖葡萄糖氧化酶（GOx）的酶生物传感器。与亲和传感器相比，酶促葡萄糖传感器的特点是具有非常高的选择性，并且对其他糖类实际上是“盲目的”。在酶促葡萄糖传感器中充当传感器的氧传感器已经相当成熟，并且可以使用紧凑且可能低成本的设备通过相位荧光法读取。不利的是，组织氧合会影响此类传感器的响应，因此必须额外测量氧分压(pO2)。这导致复合葡萄糖传感器的复杂性更高。为了确保准确补偿氧气波动，两个传感器元件（葡萄糖和参考氧气传感器）都应靠近。尽管先前已对两个光纤传感器的组合进行了概念验证，但该阵列相当庞大且不包括胰岛素导管。显然，将胰岛素导管和传感器集成到一个元件中可以显着提高患者友好性和更紧凑的设置。这是一项具有挑战性的任务，因为应该通过皮肤读取光学葡萄糖和氧气传感器。最先进的UV-vis探头不适用于皮下测量，只能用于此类“智能纹身”的概念验证研究。最近，在所谓的近红外光学窗口中吸收和发射的磷光氧探针领域取得了很大进展。该光谱区域的特点是皮肤色素、血红蛋白和水对光的吸收较低，并且来自组织的自发荧光较弱。
可植入传感器的长期性能通常会因代谢活跃细胞的积累而受到影响。它们积聚在传感器表面并加速消耗葡萄糖和氧气。此外，在传感器周围形成的纤维囊会改变葡萄糖的传质。这可以通过采集血液样本并在局部环境稳定后重新校准传感器来解决。此外，使用廉价的光学传感器与胰岛素导管相结合，可以通过每2-3天更换一次传感器来克服上述并发症。
在这篇文章中，我们提出了一个系统，该系统允许连续测量葡萄糖和同时输注胰岛素。光学传感器系统集成到连接到胰岛素泵的胰岛素输注导管中，并且只需要一个注射部位。与大多数CGM系统一样，传感器测量间质液(ISF)中的葡萄糖，该葡萄糖与血糖水平处于平衡状态。频繁的测量可提供更多信息并有助于识别低血糖或高血糖事件，这些事件可能无法通过手指刺法检测到。在未来的工作中，该系统将扩展到人工胰腺，借助算法控制胰岛素泵，该算法依赖于测量的葡萄糖水平。这种几乎无痛的解决方案有望大大简化患者的血糖测量，并降低因糖尿病而出现的急性和长期并发症的风险。
二、材料与方法
2.1.材料
葡萄糖氧化酶（来自黑曲霉的EC1.1.3.2，U/mg）、4-叔丁基苯乙烯、CG-20型氧化铝、十二烷基硫酸钠和2,2-偶氮二（2-甲基丙腈）、二乙烯基苯、戊二醛（25%水溶液）、聚（苯乙烯）（平均Mw,）和乙基纤维素（48.0-49.5%乙氧基）购自Sigma-Aldrich（sigmaaldrich）。来自牛血清的白蛋白部分V、D-(+)-葡萄糖和所有溶剂均来自Roth(carlroth)，氮气和合成空气（纯度均为99.%）来自AirLiquide(airliquide)和来自AdvanSource的水凝胶HydroMedD4（可在富临塑胶采购）。所有水溶液的制备均使用去离子水。
根据Borisov等人的方法合成了发光染料铂(II)-meso-tetra(4-fluorophenyl)四苯并卟啉。支持信息中描述了铂(II)-6-aza-13,20,27三苯基四(叔丁基苯并)-卟啉的合成。用于体内测试的20%葡萄糖溶液和0.9%生理NaCl溶液购自FreseniusKabi(fresenius-kabi)，胰岛素NovorapidU/mL购自NovoNordisk(novonordisk)。
聚四氟乙烯管购自Bola(bola)，聚对苯二甲酸乙二醇酯箔(Mylars)购自Goodfellow(goodfellow)。静脉导管Tro-Venocath3+购自TrogeMedical(trogemedical)。
2.2.制备聚叔丁基苯乙烯颗粒(ptBS)
在聚合之前，在氧化铝柱上清洗4-叔丁基苯乙烯(tBS)和二乙烯基苯(DVB)以去除抑制剂。将10.9mLtBS和2.8mLDVB混合并添加到mL0.25%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液中。将混合物用匀浆器（MiccraD1，GerberInstruments，瑞士）匀浆2分钟，并在超声波浴（TranssonicDigitalS，Elma，德国）中匀浆5分钟。将所得乳液转移至1升双颈圆底烧瓶中并在强氮气流下搅拌40分钟。加入mg2,2-偶氮二(2-甲基丙腈)并将乳液升温至95°C。大约7小时后，将反应混合物冷却至室温并转移到烧杯中。在搅拌下加入mL丙酮以沉淀得到的交联聚合物颗粒。将分散体以4rpm离心5分钟（Rotofix32，Hettich，Germany）。为了清洁，将沉淀物悬浮在大约60mL的溶剂中，超声处理10分钟并再次离心。该清洁程序用丙酮进行3次，用丙酮、乙醇和水(2:1:1v/v)的混合物进行两次，用乙醇进行两次。将颗粒在干燥箱（ED，Binder，Germany）中在60°C下干燥过夜，然后将产物（ptBS）在研钵中均化。
2.3.ptBS粒子的染色
将5mg铂(II)-内消旋-四(4氟苯基)四苯并卟啉(PtTPTBPF)在6mL氯仿中的溶液缓慢添加到ptBS在CHCl3中的10%(w/v)分散体中。将混合物搅拌15分钟并超声处理另外15分钟。在氮气流下通过蒸发除去溶剂。染色的PtTPTBPF-ptBS颗粒在60°C下干燥过夜，然后在研钵中均化。
2.4.葡萄糖生物传感器的制备
模拟胰岛素输注导管的聚四氟乙烯(PTFE)管的表面在涂层程序之前不久通过氧等离子体蚀刻(FEMTOUHP,DienerElectronic,Germany)被激活。该过程在0.3mbar的基本压力和W和40kHz的等离子体功率下进行60秒。
将1.25%戊二醛水溶液添加到10%(w/v)GOx和牛血清白蛋白(BSA)（比例1:2v/v）的水溶液中。以25kHz的超声波频率、2.2W的蒸发器功率和20mbar的聚焦气流将该酶溶液喷涂到等离子体蚀刻的导管上。涂覆过程以0.1mL/min的流速在33mm的距离下进行6秒。交联在室温下在干燥30分钟期间自发发生。
将5g乙基纤维素(EC)和2.5g水凝胶HydroMedD4溶解在g乙醇和水的混合物（比例为9:1v/v）中。将20mgPtTPTBPF-ptBS染料颗粒分散在mL不透明EC-D4溶液中。将该溶液进一步用乙醇和水的混合物（比例9:1）以1:2稀释，以喷涂在干燥的酶层顶部，蒸发器功率为4W。喷嘴和导管之间的距离为50mm涂敷时间为10分钟，流速为0.05mL/min。在明场和荧光显微镜上测定传感层的厚度。因此，导管安装在冷固化双组分环氧树脂(Epofix,struers)中。在24°C下固化后，将样品研磨（最高4粒度），用金刚石悬浮液抛光（最高0.25mm）并切片。
2.5.参考氧传感器的制备
将5mg铂(II)-6-aza-13,20,27-三苯基四(叔丁基苯并)卟啉(tbutPtNTBP)和50mg聚苯乙烯(PS)溶解在mg甲苯中。将该溶液喷涂到已经带有葡萄糖传感器的导管上。为防止葡萄糖传感器受到污染，在喷涂参比氧传感器期间用一块塑料箔覆盖它。
2.6.体外表征
用于五个传感器的定制流通池用于连续流动分析传感器对生理相关范围内不同葡萄糖浓度的响应。在从0mg/dL到mg/dL并回落到0mg/dL的阶梯梯度中进行葡萄糖浓度分布。葡萄糖水溶液在低温恒温器（DC50，ThermoHaake，Germany）中保持恒温。使用气体混合装置（MFC，MKS仪器，德国）通过溶液吹扫定义的氮气和合成空气混合物来调节溶液的氧含量。
完成阶梯梯度后，葡萄糖浓度在50小时内在45md/dL和mg/dL之间交替变化，以识别在低和高葡萄糖浓度下的传感器漂移。
2.7.体内实验
所有体内实验均在猪身上进行，符合关于保护用于科学目的的动物的指令/63/EU，并获得了奥地利联邦科学与研究部伦理委员会(BMWF66./)的批准-II/3b/)。测试对象是健康的家猪（25-30公斤），在实验过程中进行全身麻醉，监测并提供人工呼吸。
为了达到生理相关范围内的葡萄糖浓度，在高胰岛素条件下进行了葡萄糖钳实验。为此，静脉内输注医用葡萄糖溶液，以达到35mg/dL至mg/dL葡萄糖范围内的不同血糖浓度（低血糖、正常血糖和高血糖）。每5分钟采集一次动脉血样，以获得血糖浓度和氧分压的参考值。参考测量使用SuperGL2（HITADOGmbH，德国）和GEMPremier3（仪器实验室，比利时）进行。
将常用静脉导管的钢套管皮下置于猪体侧。拔出套管后，涂层导管仍留在组织中，并用医用胶带固定，以免意外拔出。测量模块位于传感器上方的猪皮肤上。通过导管注入基础(2.4U/h)和推注胰岛素(25mL/2.5min)以及等量的生理NaCl溶液，以便研究胰岛素和NaCl溶液对传感器信号的影响。未输液的导管作为参考。
2.8.灭菌
10个葡萄糖传感器元件进行了电子束灭菌（25kGry），10个进行了γ灭菌（25kGry），另外10个未灭菌作为参考。所有30个传感器都在连续流动装置中进行了体外测试，以了解它们对0mg/dL至mg/dL葡萄糖范围内的葡萄糖的响应。
2.9.细胞*性试验
将葡萄糖和氧气传感器溶液刮涂到聚酯薄膜箔上，在溶剂蒸发后获得约2.5毫米厚的层。根据间接细胞*性测试的ISO指南（ISO-5,9;ISO-12,9），在37°C下用1mL培养基提取3cm2的刀涂传感器。在用甲臜生物还原法测试细胞活力之前，将人成纤维细胞系MRC-5暴露于稀释和未稀释的提取物24小时、48小时和72小时。
三、结果与讨论
3.1.传感器系统
传感器系统由两个传感器元件组成——光学葡萄糖生物传感器和光学参考氧传感器，它们位于胰岛素输注导管的相邻部分（方案1）。
方案1.传感器系统（左）和带有集成光学传感器系统的导管（右）的横截面。
葡萄糖传感器由酶层和氧敏层组成。底层是通过使用双功能试剂戊二醛将GOx与BSA交联来制备的。当通过与BSA交联固定时，酶的稳定性得以保持。过量的酶GOx被固定，以补偿可能的活性损失。
GOx催化的葡萄糖氧化按照以下方程式发生：β-D-葡萄糖+O2+H2O→GOxD-葡萄糖酸-β内酯+H2O2。上层中的氧敏感磷光染料颗粒充当氧消耗速率的传感器。聚氨酯水凝胶D4和乙基纤维素的混合物充当氧敏感颗粒的载体和基质。它对葡萄糖起到扩散屏障的作用，但对氧气没有作用，这是有利的，因为组织中葡萄糖与氧气的比例低。生物相容性水凝胶含有约50%的水，并且对葡萄糖具有高度渗透性。相反，疏水性明显更强的乙基纤维素减慢了葡萄糖的扩散，因此降低了酶促转化并改变了葡萄糖传感器的动态范围。它确保传感器响应受到传质而不是酶反应的限制，并防止传感器的氧气消耗导致额外的局部氧气消耗。
参考氧传感器由直接涂在导管上的聚苯乙烯中的第二种磷光染料组成，用于补偿葡萄糖生物传感器的氧串扰。获得的信号是两个传感器元件测量的氧气水平(ΔpO2)之间的差异。从局部氧分压（参考氧传感器）中减去由酶促反应（葡萄糖传感器）消耗氧而产生的氧水平。
本系统中使用的导管由聚四氟乙烯制成。由于其高化学惰性和极低的摩擦系数，这种聚合物通常用于商业胰岛素输液导管和其他医疗产品，可防止生物成分的粘附。
3.2.氧气指标
内吸收和发射，以适合皮下读数；(ii)具有显着不同的光谱特性或发光衰减时间，以提供来自两个传感器元件的无偏信息；(iii)具有良好的磷光亮度，以确保足够的信噪比；(iv)共价接枝到聚合物中或高度亲油性以避免从传感材料中浸出。不幸的是，能够满足这些要求的染料非常罕见。铂(II)和钯(II)与四苯并卟啉、四萘卟啉和氮杂四苯并卟啉络合物显示出足够明亮的NIR磷光，而许多高度融合的类卟啉在NIR中吸收太远并且不发光。萘卟啉及其与苯并卟啉的分子杂化物的光稳定性相当差。因此，与四苯并卟啉和氮杂四苯并卟啉非常光稳定的铂(II)配合物是在所提出的传感器系统中应用的明显候选者。铂(II)与内消旋四(4-氟苯基)四苯并卟啉(PtTPTBPF)配合物用于葡萄糖生物传感器。它可通过nm发光二极管(LED)激发并在NIR区域发射（图1）。铂(II)与氮杂四苯并卟啉配合物的发光亮度(定义为摩尔吸收系数ε和发光量子产率Φ的乘积)明显低于PtTPTBPF。因此，需要较高浓度的氮杂苯并卟啉才能获得可比较的信号。由于报道的染料溶解度有限，我们制备了一种新的高溶解性铂（II）-6-aza-13,20,27三苯基四（叔丁基苯并）-卟啉（tbutPtNTBP，图1）。四个叔丁基使染料极易溶于普通有机溶剂和聚苯乙烯等聚合物中。即使在非常高的浓度（聚苯乙烯中染料的10%w/w）下，染料的光物理特性也得以保留，这表明染料在这些条件下不会聚集。tbutPtNTBP的吸收和发射都与PtTPTBPF的吸收和发射显着不同（图1），确保在两个发射通道中的双重激发和检测时传感器信号的良好分离。虽然理论上可以用单一光源激发两种染料，但它会导致tbutPtNTBP窗口中PtTPTBPF发射的明显干扰。tbutPtNTBP的摩尔吸收系数非常高：,M1cm1（Q波段，nm）和,M1cm1（Soret波段，nm）。NIR磷光的量子产率(λmax=nm)适中(12%)。重要的是，尽管存在给电子叔丁基基团，但新复合物的光稳定性足够高（图S7和S8）。事实上，即使在高染料浓度下，也可以获得数千个测量点，从而导致发光衰减时间的微小漂移。此外，在体内测量中，到达传感器的激发光强度大约低倍，因此在传感器的整个工作时间内潜在的光漂白效应可以忽略不计。
图1指示剂的化学结构及其在甲苯中的光谱特性。
铂(II)配合物的长寿命磷光被溶液和聚合物中的分子氧（图2）有效地淬灭。传感器元件在0mmHg至mmHg的动态范围内显示出最佳响应。尽管分辨率较低，但也可以在较高pO2下进行定量。从所谓的两站点模型（Carraway等人，年）改编而来的修正Stern-Volmer方程可用于充分拟合非线性Stern-Volmer图（τ0/τvs.pO2）：
图2.葡萄糖和参考氧传感器在25°C下的寿命和Stern-Volmer图。
其中τ是给定氧气浓度(pO2)下的寿命，τ0是厌氧条件下的寿命，f1和f2是两种环境中每一种的总排放量的分数（f1f21），KSV1和KSV2是Stern–每个组件的Volmer常数。
3.3.传感器元件的涂层
传感器元件在导管上的涂层是关键步骤。为了实现传感器材料对PTFE导管的令人满意的粘附，导管表面在涂层程序前不久通过氧等离子体蚀刻激活。检查了将传感器材料沉积到PTFE导管上的不同涂层方法。由于良好的可重复性和更好的适用性，通过使用覆盖掩模将两个传感器元件涂覆在导管的相邻部分上，喷涂涂层优于其他方法（例如浸涂、手动沉积和喷墨印刷）。其他选择标准是方法的简单性和易于放大的可能性。
涂层传感器的显微镜检查显示传感器材料在导管上具有良好的附着力。发现层厚度是均匀的。例如，葡萄糖传感器（毫米）由大约32毫米厚的氧敏感层和大约13毫米厚的酶层组成。所有涂层导管在生理NaCl溶液中保存5天，超过了3天的计划使用期限。此外，将导管插入皮下组织是一个关键步骤，因为传感器材料可能会分离。在体外实验中，导管被插入和从一块牛肉中取出数次。等离子蚀刻的导管显示出令人满意的传感器材料粘附性，而当导管表面未激活时，传感器很容易被移除。在猪的体内实验中也获得了相同的结果。
3.4.读取模块
用于传感器读出的模块应满足以下要求：(i)足够小，可以直接在患者皮肤上进行舒适的测量；(ii)包含两个单独的通道，用于询问葡萄糖和参考氧传感器；(iii)有效引导激发光并收集发射光，同时减少接收到的背景光；(iv)设计简单，依靠廉价的光电成分。牢记这些要求，我们制造了一种新型小型化相位荧光计，称为BiLuMOS（光学传感器的双发光测量），如图3所示。
图3.(a)BiLuMOS读出模块及其组件；(b)两个传感器元件中指示剂的吸收光谱和用于激发指示剂的LED的发射光谱；(c)指示剂的发射光谱和各个滤光片的透射光谱。
这两个通道针对tbutPtNTBP和PtTPTBPF的读出进行了优化，并包括一对不同的LED、激发和发射滤波器（图3b）。LED倾斜45°/15°并偏移以与导管上的传感器系统完全匹配，导管必须插入组织3-4毫米深。两个光电二极管彼此相邻放置，它们的光路分开。导管上方的这个位置不是最佳的，但可以通过不同发射波长不需要分束的事实来补偿。如果两个探测器只使用一个最佳孔径，这将是必要的，并且会导致分束器处的额外传输损耗。传感器系统相对于测量模块的固定位置允许缩短从LED通过传感器到光电二极管的光路，从而提高光收集效率，抑制背景光并最大限度地减少光学元件的数量。
光电二极管顶部的发射滤光片充当波导，因为它们被空气包围。它们增加了发射光的孔径，同时减少了背景光的数量（自发荧光）。使用的所有滤波器成本相对较低，旨在实现良好的信号分离。两个通道都在激发侧使用Calflex滤波器（Schott，Austria）。发射滤光片组1（葡萄糖传感器）由定制的带通滤光片和RG9长通滤光片（奥地利肖特）组成，而发射滤光片组2（参考氧传感器）由RG滤光片组成（Schott，奥地利）和特殊中蓝带通滤波器（Lee，美国）。如图3c所示，两个通道之间存在串扰。更窄的干涉滤光片可以进一步改善来自两个指标的排放的分离。
有关测量电子设备、测量模块和相位荧光法测量原理的更多信息，请参见补充数据。
3.5.体外表征
图4a显示了葡萄糖传感器对不同分析物浓度的完全可逆响应，检测限(LOD)为2mg/dL。实现了从0mg/dL到mg/dL的动态范围，涵盖了低血糖(o40mg/dL)、正常血糖和高血糖(mg/dL)的生理相关范围。由于糖尿病患者的高血糖波动可能超过mg/dL，因此目前正在优化所提出传感器的动态范围，以实现扩展到更高葡萄糖浓度的更线性响应。
图4.葡萄糖传感器对分析物的动态可逆响应：(a)在25°C下在空气饱和的葡萄糖水溶液中进行连续流动测量；(b)传感器对葡萄糖响应的温度依赖性。
葡萄糖传感器在50小时的测量期内显示出可接受的稳定性，在mg/dL和45mg/dL初始传感器信号的传感器漂移为±0.13%/h，在45mg/dL为0.38%/h。传感器漂移将与分析物无关的信号变化描述为初始信号随时间的百分比。这种传感器漂移可以通过在24小时后重新校准传感器来补偿。葡萄糖传感器可以在4°C下储存数周而灵敏度没有明显变化，这是由于酶过剩和交联酶的高稳定性所致。响应时间t90（定义为信号从信号最大值的0%变化到90%所需的时间）为秒，这对于CGM来说已经足够快了。
葡萄糖生物传感器在35°C和40°C之间的生理相关范围内仅显示出对温度的轻微响应（图4b）。温度串扰的起源相当复杂，因为温度会影响葡萄糖和氧气的扩散速率、葡萄糖的酶促氧化速率和氧气传感器的灵敏度。由于植入的传感器系统将不受周围组织、皮肤以及测量模块的环境温度变化的影响，因此预计温度串扰可以忽略不计。
图5显示了氧气和葡萄糖传感器对分析物氧气和葡萄糖的响应。参考传感器只对氧气有反应（图5a），这表明在氧气传感器的检测通道中没有来自葡萄糖传感器的光学干扰。另一方面，葡萄糖传感器的响应取决于葡萄糖的浓度和pO2，这可以从酶促反应的机理中推断出来。数据证实了葡萄糖定量参考氧传感器的必要性。显然，该传感器适用于研究范围从45mmHg到mmHg的葡萄糖测量。细胞间氧的平均浓度为56..9mmHg，皮下pO2的波动可能高达15.8mmHg（Simonsen等，）。可以组合单个传感器的校准（图5c）以产生ΔpO2的依赖性（定义为两个传感器获得的pO2值的差异）。
图5.参考氧传感器(a)和葡萄糖传感器(b)对两种分析物的响应。计算两个传感器(c)的pO2值差异的响应。
3.6.优化传感器的插入深度
在一项初步研究中，实现了一种光学装置（图6），以使用牛肉和脂肪的组合来模拟葡萄糖传感器元件的体内读数。牛肉用于模拟组织和皮肤的血液供应。存在于肌肉组织中的肌红蛋白的阻尼效应预计与体内测量期间的血红蛋白的阻尼效应相似。牛肉脂肪用于模拟荧光散射。一个2mm的平面传感器点位于厚度在2.5mm和10mm之间的肉层下方，以检查信号损失和插入深度之间的关系。
图6.模拟组织吸收和散射的系统设置方案。
观察到的背景光由组织成分的自发荧光、散射光和反射光组成。背景光对传感器信号（发光衰减时间）的影响可以用数学方法进行补偿。使用双频校正（Borisov等人，6年）进行的寿命测量可以得出厚度不超过5mm的机密结果（表1）。事实上，计算出的衰减时间（反映氧合程度）与没有组织的传感器的衰减时间相同。猪的体内测量也获得了类似的结果（数据未显示）。从表1中可以清楚地看出，当信噪比较低时，双频校正达到其极限。在肉层厚度为10mm（~50%背景光）时，寿命测量变得不可靠，这从计算的发光寿命值显着降低中可以看出（表1）。
表1信号强度和计算的发光寿命对传感器插入深度的依赖性。
这种限制可能可以通过时间分辨测量来克服，这可以在几微秒的短暂延迟后完全消除短暂的背景。这种替代测量方法需要改变读出模块的电子设备，因此在当前工作中没有执行。尽管如此，可以得出结论，使用所使用的装置以及传感器系统放置在中等插入深度，可以通过皮肤和组织可靠地测量磷光寿命并因此测量氧合。
3.7.体内实验
渴望的实验目标是显示新设置的稳定性和准确性，并将其与全血中的参考测量值进行比较。使用克拉克误差网格分析(EGA)评估了所提出系统的临床准确性。在植入前对每个传感器元件进行两点校准（需氧：21%氧气和厌氧：0%氧气）。通过将氧补偿数据(ΔpO2)与血液中测量的分析物浓度进行比较，对氧补偿数据(ΔpO2)进行了回顾性评估（非在线）。图7将使用三个光学葡萄糖传感器获得的间质液葡萄糖水平与参考血糖值进行了比较。需要分钟的预热时间，因为植入导管会导致组织损伤或出血，从而改变传感器周围组织的生理机能。在此期间，无法进行可靠的血糖监测测量，因此未在图7中显示。
图7.体内实验结果：参考血糖水平与系统生成数据的比较（分钟运行时间）。
显然，新的光学系统适用于连续血糖监测。系统生成的数据以时间延迟跟踪血糖水平，与2分钟到22分钟之间的时间滞后相当，这已针对不同的商业CGM系统进行了报道。执行EGA时未考虑血糖水平和间质液中葡萄糖水平之间的生理和系统条件滞后时间执行EGA时考虑了不同的磨合时间。图8中显示的数据来自一组三个在体内测量的传感器。误差条仅针对误差网格的区域A中的数据显示，以保持图表简单，但所有区域的范围都相似。在没有磨合时间的情况下，所有数据的80%位于区域A和B，而0%位于区域E。磨合时间的延长可以改善这些结果。在分钟的预热时间后，95%的所有数据位于区域A和B，低于商业CGM系统的平均预热时间分钟。
图8.Clarke误差网格分析的结果取决于运行时间。
同时输注胰岛素和生理氯化钠溶液对传感器的行为没有显着影响。结果发表在其他地方。Lindpointner等人和Hermanides等人。(8)提出了类似的建议。因此可以得出结论，可以将胰岛素输注和葡萄糖测量结合在一根导管中，这是对I型糖尿病的实际可能治疗选择的根本改进，并且将被广泛接受。
3.8.传感器的生物相容性和灭菌
传感器的生物相容性对于它们的医疗应用是强制性的。它通过推荐的ISO测试进行了评估。将稀释和未稀释提取物的细胞活力（脱氢酶活性）与对照的细胞活力进行比较（图S10）。由于传感器材料的洗脱液在任何测试时间点均未显示脱氢酶活性显着降低，因此根据医疗产品的ISO指南，两种传感器元件的氧敏感层均可归类为无细胞*性。
无金属卟啉及其配合物属于单线态氧的有效光敏剂，因此可能具有光*性。由于水中单线态氧的衰减时间短（~3ms），光*性效应仅对非常小的物体（如卟啉共轭物）显着或染料掺杂的纳米粒子。在我们的工作中，卟啉指示剂嵌入疏水性聚苯乙烯基聚合物中，由于长的扩散路径和短的单线态氧寿命，确保了单线态氧的有效失活。值得注意的是，高亲油性染料与疏水性聚苯乙烯具有极好的相容性，并且在水性介质中没有任何浸出。
考虑到葡萄糖生物传感器，潜在的负面影响可能是由葡萄糖酶促氧化过程中产生的过氧化氢(H2O2)引起的。H2O2会引起传感器附近组织的局部刺激，并可能导致炎症。添加过氧化氢酶，促进过氧化氢分解为氧气和水，可以最大限度地减少这种影响，目前正在研究中。
在应用于人体之前对传感器进行消*是另一个关键问题。在医疗技术中，常用四种不同的灭菌技术：环氧乙烷化学灭菌、辐照灭菌（γ-和电子束灭菌）和蒸汽压力灭菌。化学和蒸汽压力灭菌都是在恶劣条件下进行的，预计会显着降低GOx的活性。辐照灭菌更有希望，并且可以在产品的最终外包装中进行灭菌，而无需额外的工艺步骤。如前所述，不同剂量的γ和β光束（15、25、50kGry）不会影响氧气指示剂的吸收和发射特性。选择25kGry的辐射剂量用于葡萄糖传感器的灭菌，因为该剂量通常用于医疗设备的灭菌。这些实验表明，在用25kGry进行β和γ灭菌后，GOx仍然有活性。γ灭菌期间的辐射暴露导致传感器响应的变化，而使用β灭菌时影响可以忽略不计。可以得出结论，β射线灭菌是酶促葡萄糖生物传感器的优选方法。
四、结论
我们提出了一种新的传感器系统，用于连续监测间质液中的葡萄糖。该系统依赖于基于两个近红外磷光指示器的两个光学传感器（葡萄糖生物传感器和参考氧传感器）的组合。结果表明，涂在胰岛素导管表面的传感器可以使用一种新型紧凑且低成本的2通道相位荧光计通过皮肤读取。用传感器系统获得的葡萄糖水平与参考血糖值显示出良好的相关性。传感器可以通过β辐射进行消*，而不会对响应产生显着影响。通过优化扩散层的厚度和组成使对葡萄糖的响应线性化有望简化校准程序，目前正在研究中。进一步的改进包括优化光学设置和指示剂化学成分，以更好地分离来自两个传感器的发光信号。可以得出结论，这项工作为开发具有自动连续血糖测量和调整胰岛素输送的人工胰腺铺平了道路。
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